隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，轉(zhuǎn)基因食品的安全性與標(biāo)識(shí)管理已成為全球食品安全監(jiān)管的核心議題之一。我國(guó)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 預(yù)包裝食品標(biāo)簽通則》明確要求，含轉(zhuǎn)基因成分的食品需依法標(biāo)注，而準(zhǔn)確篩查食品中的轉(zhuǎn)基因成分是落實(shí)該要求的關(guān)鍵前提。

熒光定量PCR技術(shù)因具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、定量準(zhǔn)確等優(yōu)勢(shì)，已成為轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)的主流技術(shù)，其性能直接依賴于檢測(cè)儀器的穩(wěn)定性與精準(zhǔn)度。博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)的熒光定量PCR儀作為國(guó)產(chǎn)自主研發(fā)儀器，具備96孔快速檢測(cè)模塊、實(shí)時(shí)熒光采集系統(tǒng)及內(nèi)置質(zhì)控軟件，但目前針對(duì)其在食品安全檢疫場(chǎng)景下的系統(tǒng)驗(yàn)證研究尚未見報(bào)道。本研究通過標(biāo)準(zhǔn)品與實(shí)際樣品檢測(cè)，全面驗(yàn)證該儀器的應(yīng)用可行性，為國(guó)產(chǎn)儀器在食品安全監(jiān)管中的推廣提供數(shù)據(jù)支持。

一、材料與方法

（一）實(shí)驗(yàn)材料

1、儀器：博清生物熒光定量PCR儀；對(duì)照儀器為國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)驗(yàn)證儀器；核酸提取儀。

2、試劑：轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)試劑盒（含CaMV35S啟動(dòng)子、NOS終止子引物探針，大豆Lectin、玉米ADH1內(nèi)參基因引物探針），；核酸提取試劑盒；無酶水。

3、樣品：

標(biāo)準(zhǔn)品：轉(zhuǎn)基因大豆質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品（濃度梯度：101?~101拷貝/μL）、轉(zhuǎn)基因玉米質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品（同濃度梯度）；

實(shí)際樣品：20份作物樣品（10份大豆、10份玉米），采集自本地農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，其中5份為已知轉(zhuǎn)基因陽性樣品（用于驗(yàn)證）。

（二）實(shí)驗(yàn)方法

1、核酸提取

取200mg樣品粉末，采用核酸提取試劑盒按說明書操作，提取基因組DNA；用超微量分光光度計(jì)檢測(cè)DNA純度（A260/A280 需在1.8~2.0之間）與濃度，調(diào)整至50ng/μL備用。

2、PCR 反應(yīng)體系與程序

反應(yīng)體系（總體積 20μL）：2×熒光定量PCR Mix 10μL，上游引物（10μmol/L）0.8μL，下游引物（10μmol/L）0.8μL，探針（10μmol/L）0.4μL，模板DNA 2μL，無酶水6μL。

反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，60℃退火延伸 30s（采集熒光信號(hào)），共40個(gè)循環(huán)；溶解曲線分析：95℃15s，60℃1min，95℃15s。

3、性能評(píng)價(jià)指標(biāo)

靈敏度：對(duì)101?~101 拷貝/μL的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行梯度檢測(cè)，記錄最低可檢出的拷貝數(shù)；

特異性：檢測(cè)非轉(zhuǎn)基因大豆、非轉(zhuǎn)基因玉米、水稻、小麥樣品，驗(yàn)證是否出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增；

重復(fù)性：選取103拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)品及2份陽性實(shí)際樣品，各重復(fù)檢測(cè)3次，計(jì)算Ct值的CV；

一致性：用博清生物與對(duì)照儀器同時(shí)檢測(cè)20份實(shí)際樣品，對(duì)比檢測(cè)結(jié)果的符合率。

二、結(jié)果與分析

（一）靈敏度檢測(cè)結(jié)果

博清生物熒光定量PCR儀對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆、玉米標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)結(jié)果顯示，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品濃度降至10拷貝/μL 時(shí)，仍可穩(wěn)定檢出熒光信號(hào)（Ct值≤38），且溶解曲線呈單一峰值（Tm值約68℃），無非特異性擴(kuò)增。該靈敏度滿足我國(guó)及歐盟對(duì)轉(zhuǎn)基因成分“最低檢出限≤0.1%”的監(jiān)管要求。

（二）特異性檢測(cè)結(jié)果

對(duì)非轉(zhuǎn)基因大豆、玉米及水稻、小麥樣品的檢測(cè)中，博清生物熒光定量PCR儀僅在轉(zhuǎn)基因陽性標(biāo)準(zhǔn)品中出現(xiàn)特異性擴(kuò)增，其余樣品均無熒光信號(hào)（Ct值＞40），表明該儀器對(duì)轉(zhuǎn)基因核心元件的檢測(cè)無交叉反應(yīng)，特異性良好。

（三）重復(fù)性檢測(cè)結(jié)果

103拷貝/μL標(biāo)準(zhǔn)品及2份陽性實(shí)際樣品的3次重復(fù)檢測(cè)中，Ct值的CV分別為1.2%、1.5%、1.8%（均＜2%），表明博清生物熒光定量PCR儀的檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定性滿足科研與檢疫的重復(fù)性要求。

（四）與標(biāo)準(zhǔn)儀器的一致性對(duì)比

20份實(shí)際樣品的檢測(cè)結(jié)果顯示，博清生物熒光定量PCR儀與對(duì)照儀器的陽性檢出結(jié)果完全一致（5份陽性，15份陰性），符合率達(dá)100%，證明該儀器的檢測(cè)準(zhǔn)確性與國(guó)際主流儀器相當(dāng)，可替代進(jìn)口儀器用于日常檢疫工作。

三、討論

本研究從靈敏度、特異性、重復(fù)性及一致性四個(gè)維度，驗(yàn)證了博清生物熒光定量PCR儀在轉(zhuǎn)基因成分篩查中的應(yīng)用性能。結(jié)果表明，該儀器具有以下優(yōu)勢(shì)：

（一）高靈敏度：10拷貝/μL的檢出限可覆蓋低含量轉(zhuǎn)基因成分的篩查需求，避免因檢出限不足導(dǎo)致的漏判；

（二）強(qiáng)特異性：對(duì)非目標(biāo)作物無交叉反應(yīng)，減少假陽性結(jié)果對(duì)監(jiān)管決策的干擾；

（三）高穩(wěn)定性：CV≤1.8%的重復(fù)性表現(xiàn)，保證了批量樣品檢測(cè)的結(jié)果可靠性；

（四）高性價(jià)比：作為國(guó)產(chǎn)儀器，其檢測(cè)性能與進(jìn)口儀器相當(dāng)，但采購(gòu)與維護(hù)成本更低，更適合基層檢疫機(jī)構(gòu)推廣。

需注意的是，本研究?jī)H針對(duì)CaMV35S、NOS等常見轉(zhuǎn)基因元件，后續(xù)可進(jìn)一步擴(kuò)展對(duì)CP4-EPSPS、PAT等特異性基因的檢測(cè)驗(yàn)證，以覆蓋更多轉(zhuǎn)基因作物類型。此外，結(jié)合博清生物儀器的內(nèi)置質(zhì)控軟件，可實(shí)現(xiàn)檢測(cè)數(shù)據(jù)的自動(dòng)記錄與溯源，進(jìn)一步提升檢疫工作的效率與規(guī)范性。

博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)的熒光定量PCR儀在食品安全檢疫的轉(zhuǎn)基因成分篩查中，表現(xiàn)出優(yōu)異的靈敏度、特異性與重復(fù)性，且與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)驗(yàn)證儀器的檢測(cè)結(jié)果完全一致。該儀器可滿足我國(guó)食品安全監(jiān)管對(duì)轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)的技術(shù)要求，為國(guó)產(chǎn)熒光定量PCR儀在食品檢疫領(lǐng)域的應(yīng)用提供了可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，具備廣闊的推廣前景。